Caracterització de macròfags de moll d’ós (BMM) del model murí de la lisinúria amb intolerància a proteïnes (LPI)

Abstract

Els aminoàcids són elements essencials pel nostre organisme. Aquests poden ser captats per diferents teixits gràcies a les proteïnes hidrofòbiques situades en les membranes cel·lulars anomenades transportadors. Mutacions en diferents transportadors, donen lloc a una gran varietat de malalties. El gen Slc7a7,codifica per una proteïna que intercanvia obligatòriament aminoàcids bàsics per aminoàcids neutres amb Na+ i que es localitza a la membrana basolateral (Torrents et al., 1999) de cèl·lules epitelials. Mutacions en el transportador y+LAT1 que s’expressa principalment a l’intestí i al ronyó causen la Lisinuria amb Intolerància a Proteïnes (LPI) (Torrents et al., 1999). El fenotip de la malaltia és molt variat i, s’ha observat que els macròfags són un dels tipus cel·lulars més afectats. En estudis previs al grup, s’ha observat que la concentració de ferro intracel·lular en macròfags de polpa vermella de la melsa és major i, per altra banda, s’han observat desequilibris en la concentració de NO3-, i la producció d’òxid nítric per macròfags activats requereix de la ingesta d’arginina extracel·lular, aminoàcid en baixes concentracions en pacients LPI. La hipòtesi de partida del present Treball de Final de Grau és avaluar l’impacte de la manca de y+LAT1 en el macròfag i/o l’ambient generat per la falta de y+LAT1 en cèl·lules epitelials (baixa concentració d’arginina i alta concentració d’amoni) en l’expressió dels gens involucrats en l’activació clàssica i en la producció de NO per part dels macròfags. Així doncs, mitjançant tècniques de cultius primaris, anàlisis quantitatiu d’expressió gènica i quantificació de proteïnes, l’objectiu principal del projecte és la caracterització de macròfags procedents de moll d’ós amb diferents estímuls, amb l’objectiu d’identificar i verificar els gens implicats en la senyalització dels macròfags via M1, diferències d’expressió d’aquests gens en diferents condicions, analitzar el metabolisme del ferro en macròfags i avaluar la recuperació del fenotip amb citrul·lina. Els resultats obtinguts mostren diferències en l’activació dels gens implicats en l’activació via M1 en medis diferents, diferències en la producció de NO en concentracions variants d’arginina, recuperació dels valors normals de NO en presència de citrul·lina i diferències en l’expressió gènica de gens relacionats amb el ferro en presència d’hemo. Aquests poden ser un punt de partida per altres anàlisis destinats a verificar la capacitat de fagocitosis i anàlisis de la concentració intracel·lular d’arginina en macròfags amb l’objectiu de trobar un model que sigui capaç d’explicar el mecanisme metabòlic de la malaltia i, així poder trobar possibles tractaments terapèutics pels afectats amb aquesta malaltia.

Aminoacid are essential elements for our organism. They can be captured through different tissues thanks to hydrophobic proteins located on the cellular membrane, named transporters. Mutations on these transporters give a wide range of disease. The Slc7a7 gene codifies for a protein which is an obligated exchanger of basic aminoacids for neutral aminoacids with Na+, and it’s located on the basolateral membrane of epithelial cells. Mutations on the y+LAT1 transporter (Torrents et al., 1999), which is mainly expressed on the intestine and kidney, cause Lisiniuric Protein Intolerance (LPI) (Torrents et al., 1998). The disease phenotype covers an extensive range of characteristics and, it has been pointed out that, macrophages are one of the most type of cells affected. On previous studies carried out on our group, it has been observed an intracellular accumulation of iron in red pulp macrophages and imbalances of the concentration of NO3-. The production of NO in activated macrophages requires of extracellular arginine, an aminoacid which is present in low concentrations on plasma in LPI patients. The hypothesis of this Final Degree Project is to assess the impact of the lack of y+LAT1 in macrophages and/or the environment generated by the lack of y+LAT1 in epithelial cells (low concentration of arginine and high concentration of ammonia) in the expression of genes involved in the classic activation and, the NO production by macrophages. Thus, using primary cultures techniques, quantitative analysis of gene expression and protein quantification, the main objective of the project is the characterization of bone marrow macrophages with different conditions, aiming to identify and verify genes involved in signaling through M1 macrophage pathway, differences in expression of these genes in different conditions, analyze the iron metabolism in macrophages and asses the recovery of the phenotype with citrulline. The results show differences in the activation of genes involved in activation of M1 pathway in different environments, differences in NO production through different concentrations of arginine, the recovery of normal levels of NO in the presence of citrulline and differences in gene expression of genes related to the iron metabolism in presence of heme. These can be a starting point for other tests designed to verify whether the capacity of erythrophagocytosis is affected and analysis of intracellular concentration of arginine in macrophages, in order to fins a model which is able to explain the metabolic mechanisms of the disease in order to find a possible therapeutic treatment for those affected with the disease.