Biologia de sistemes aplicada a la identificació de dianes rellevants en la progressió del carcinoma renal de cèl·lula clara (ccRCC)

Abstract

El carcinoma renal de cèl·lula clara (ccRCC) s’origina a les cèl·lules epitelials del túbul proximal renal, presenta un 90% dels carcinomes renals i causa 100.000 morts cada any arreu del món. És el càncer renal més agressiu, resistent a quimioteràpia i radioteràpia, i no presenta símptomes ; per això gran part dels diagnòstics es fan en fase avançada de la malaltia, quan els tumors ja han fet metàstasi. Per tal d’identificar biomarcadors diagnòstic i/o terapèutics, el grup de Recerca Fisiopatologia Renal de l’Institut de Recerca Vall d’Hebron va col·lectar mostres quirúrgiques tumorals renals per analitzar l’expressió genètica de les mostres tumorals respecte mostres sanes. S’identifica per primera vegada el marcador oncogènic KIM-1, proteïna expressada en cèl·lules del túbul proximal danyades, que augmenta l’expressió de forma molt important en cèl·lules tumorals de ccRCC respecte les cèl·lules no tumorals. Una expressió elevada de mRNA està correlat amb procesos de dispersió i proliferació que intervenen en el desenvolupament d’un fenotip maligne. Es proposa KIM-1 no només com a biomarcador específic sinó també com a possible diana terapèutica. S’observa la relació de KIM-1 amb les característiques patològiques del tumor en pacients i per entendre la funció de KIM-1 en el procés tumoral, es col·lecten mostres de pacients tractats amb nefrectomia parcial o total a causa d’un carcinoma renal, per estudiar l’expressió genètica. S’estableixen línies cel·lulars amb diferents expressions de KIM-1 per identificar gens relacionats amb KIM-1 per anàlisi de microarray. D’entre els gens que modifiquen l’expressió en funció de l’expres- sió de KIM-1 hi ha la IL-6, interleucina que es troba altament expressada en tumors de ccRCC en estadis metastàtics, i està relacionada amb la baixa supervivència. L’augment dels nivells d’expressió de IL-6 correlaciona amb els nivells de fosforilació en residus de Y705 i Ser727 del factor de transcripció STAT-3. La STAT-3 activa factors transcripcionalment relacionats amb angiogènesi i metàstasi. Estudi realitzat pel laboratori de Fisiopatologia Renal determinen que l’augment de KIM-1 provoca l’augment de la fosforilació de pSer727STAT-3 i el silenciament de KIM-1 provoca la disminucio d’aquesta fosforilació2. Es fa un estudi de correlació dels nivells de pSer727STAT-3 en tumors localitzats de pacients durant 10 anys de seguiment i diagrama Kaplan-Meier, on es mostra la taxa de supervivència entre pacients amb nivells alts i baixos de pSer727STAT-3. Es troben associacions entre la pSer727STAT-3 i la supervivència així com la progressió del càncer. Es fa un estudi de biologia de sistemes (per ANAXOMICS Biotech) a partir dels resultats del microarray, per seleccionar gens i vies metabòliques d’interès per estudiar. S’obté una llista de gens seleccionats, entre ells IL-6, STAT-3 i PPP2R2C. PPP2R2C és una subunitat de PP2A que actua com a fosfatasa específica per residus de Serina i Treonina. En cèl·lules amb sobreexpressió de KIM-1, l’expressió de PPP2R2C disminueix, i al contrari. Un estudi evidencia la possible relació entre PP2A i la regulacio de senyal de STAT-3(41). En funció dels resultats obtinguts per ANAXOMICS s’estableix la relació entre l’augment de KIM-1, la disminució de PPP2R2C i l’augment de pSer727STAT-3. A partir de cèl·lules de ccRCC 769-P amb diferents expressions de KIM-1 es comproven resultats previs. Es confirma la relació directa entre l’expressió de KIM-1 i pSer727STAT-3 a nivell protèic. Per comprovar la correlació directa entre KIM-1 i PPP2R2C es fan per duplicat anàlisi qPCR i Western Blot. Per tal de comprovar si la relació entre els nivells de KIM-1 i pSer727STAT-3 està directament relacionat amb els nivells de PPP2R2C es transfecten transitòriament cèl·lules 769-P control i sh851 silenciada per KIM-1, doncs en aquesta situació PPP2R2C està sobreexpressada, amb siRNA de PPP2R2C cèl·lules amb diferent expressions de KIM-1. Les transfeccions, tant realitzades amb PEI com amb Lipofectamina (com a agents transfectants) no han donat el resultat esperat, de ma- nera que no s’ha pogut determinar la correlació directa entre PPP2R2C i pSer727STAT-3 en funció de KIM-1. PPP2R2C és un candidat per biomarcador terapèutic de ccRCC, és important seguir en aquesta línia d’investigació per aconseguir identificar dianes terapèutiques i diagnòstiques de ccRCC, el càncer renal més agressiu.

Clear cell renal carcinoma (ccRCC) originates in epithelial cells from renal proximal tubule, is one of the 90% renal carcinomas, and takes 100.000 lifes every year around the world. Is the most aggressive renal cancer, chemotherapy and radiotherapy resistant, and does not show any symptoms, the reason why most of the diagnostics are made when the illness is already advanced, in when the tumor is in metastatic stage. To identify diagnostic and prognosis biomarkers, Fisiopatologia Renal Group from Vall d’Hebron Institute of Research collected tumor samples to analyze it in comparison of healthy samples. Is first time identified KIM-1 as an oncogenic target, protein expressed in renal proximal tubule cells damaged which increases the expression in an important way in ccRCC tumor cells respect non tumor cells. Elevated expression of KIM-1 mRNA is related to dispersion processes and proliferation, which intervene in the development of malignant phenotype. It is proposed KIM-1 as a specific biomarker and as a possible therapeutic target. It is observed the relation between KIM-1 and the ccRCC tumor pathologic characteristics from patients, and to better understand the function of KIM-1 in the tumor process, cells with different expressions of KIM-1 are stablished to identify genes related to KIM-1 by using microarray technique. Of all the genes which modify the expression depending on KIM-1 expression, is found IL-6, interleukin highly expressed in ccRCC tumors in metastatic stages, related to poor survival of the patient. The increase of IL-6 expression levels correlates to phosphorylation levels of Tyr and Ser residues from the transcription factor STAT-3. STAT-3 activates transcriptional factors related to angiogenesis and metastasis. An study made by Fisiopatologia Renal Group determine the increasing of KIM-1 expression causes the increasing of pSer727STAT-3, and the expression inhibition of KIM-1 leads the reduction of this phosphorylation2. The study made from localized tumors from 10 years medical follow-up and the phosphorylation levels of pSer727STAT-3 shows in diagram Kaplan Meier the relation between pSer727STAT-3 and survival. System Biology study is made from the transcriptomic data, to select genes and metabolic pathways involved. Of all the genes achieved IL-6, STAT-3 and PPP2R2C are found. PPP2R2C is a subunit from PP2A which acts like a specific phosphatase to Serine and Threonine residues. Overexpressed KIM-1 cells show the downregulation of PPP2R2C, and the opposite. Study made in 2014 shows the evidence of the relation between PP2A and the signal regulation of STAT-341. Based on the obtained results from ANAXOMICS, the relation between the increasing KIM-1, decreasing PPP2R2C and increasing pSer727STAT-3 is stablished. With 769-P ccRCC cells with different KIM-1 expressions the previous results are confirmed. The direct relation of KIM-1 expression and pSer727STAT-3 expression is confirmed by Western Blot. To prove the direct correlation between KIM-1 and PPP2R2C are made different analysis are made such as qPCR and Western Blot. To find out the if the relation between KIM-1 levels and pSer727STAT-3 are direclty related to PPP2R2C levels, 769-P control and sh851 (silenced KIM-1) cells are transfected with PPP2R2C siRNA, causing PPP2R2C normal expression in control cells, and PPP2R2C overexpression when KIM-1 is silenced. The transfections were done with PEI and Lipofectamine as a transfectant reagent. Unfortunately, both transfections failed, so the way that PPP2R2C directly regulates pSer727STAT-3 was impossible to determine. PPP2R2C is an important candidate to ccRCC therapy biomarker, is really necessary to keep investigating in this investigation lines.