Generation of a cellular model, based on CaCO2 cells, to study tight junction's formation and dynamics. CRISPR/Cas mediated gene edition to fluorescently tag the occludin protein

Abstract

Tight junctions are present in all epithelial tissues and are involved in several processes of signalling and barrier formation. Although the proteins that compose them are known, some of the exact mechanisms that drive them remain unclear. For this purpose, we have generated a CaCO2 cell line capable of expressing a fusion protein between occludin, a member of tight junction protein complex, and mEmerald, a fluorescent protein derived from GFP. This will allow the study of tight junctions in living cells. Throughout this project, we generated two plasmids needed for carry out CaCO2 genome edition. We transfected the cells with one plasmid encoding custom Cas-9 endonuclease plus a specific single-guide RNA accompanied by a plasmid bearing the repair sequence, thus producing a double strand break in the cellular genome and re-writing it to generate a mEmerald-occludin fusion protein. Furthermore, we verified the expression of the fusion protein by western blot analysis and successfully used the derived cells in single particle tracking studies.

Les unions estretes estan presents en tots els teixits epitelials i estan involucrades en processos de senyalització i formació de barreres. Encara que les proteïnes que les componen són conegudes, alguns dels mecanismes que les controlen encara no estan clars. Per a aquest propòsit, hem generat una línia cel·lular de cèl·lules CaCO2 capaç d'expressar una proteïna de fusió entre l'ocludina, un component de les unions estretes, i mEmerald, una proteïna fluorescent derivada de GFP. Això pot permetre l'estudi de les unions estretes en cèl·lules vives. Al llarg d'aquest projecte, hem generat dos plàsmids necessaris per dur a terme l'edició del genoma de les CaCO2. Vàrem transfectar les cèl·lules amb un plàsmid que codifica per l'endonucleasa Cas-9 amb un RNA guia i amb altre plàsmid portador de la seqüència de reparació. D'aquesta manera, vàrem produir una doble rotura de cadena a l'ADN i aquest es va reparar amb la seqüència que codifica per mEmerald-ocludina. A més, vàrem confirmar l'edició per blotting dels extractes de proteïna dels diferents clons i varem obtenir resultats positius per a l'edició amb la tecnologia CRISPR. Per altra part, la proteïna de fusió s'ha provat en estudis de rastreig de partícules obtenint resultats similars als extrets amb altres tècniques de marcatge.