Diseño y aplicación de técnicas de vitrificación en equilibrio para la criopreservación de corazón y encéfalo de Mus musculus

Abstract

La criopreservación tiene como objetivo conservar células, tejidos y, en palabras mayores, organismos complejos. La motivación del proyecto ha sido el alto rango de aplicaciones que podría proporcionar la criopreservación de órganos y organismos para la sociedad, desde la preservación de órganos dispuestos para trasplantes, la preservación de muestras biológicas para la investigación biomédica y evasión de problemas de infertilidad causados por tratamientos de quimioterapia, hasta la apertura del camino hacia la criopreservación de organismos complejos. Hasta la fecha, y tras décadas de estudio, el Stat of Art de la criopreservación se encuentra en la vitrificación y trasplante exitoso de riñones de conejo. Para criopreservar células aisladas se utiliza la técnica del Slow freezing, donde se induce, de forma controlada, la formación de cristales de hielo para la reubicación de las células individuales entre las dendritas del cristal, protegiendo a las mismas de daños mecánicos. En la criopreservación de tejidos se utiliza la vitrificación ultrarrápida, de 100 ⁰C/min, formando un vidrio amorfo que no permite el crecimiento de cristales debido a su alta viscosidad. Para órganos complejos el único método exitoso comprobado hasta el momento es la vitrificación en equilibrio, que concilia la concentración necesaria de crioprotector como para evitar la formación de cristales a cada temperatura, y la máxima para evitar la toxicidad a esa temperatura. El proceso evoluciona con una curva de concentración y temperatura a lo largo del tiempo. Esto permite un enfriamiento homogéneo para sistemas biológicos voluminosos sin la necesidad de que deba ser ultrarrápido. Se ha utilizado la técnica de vitrificación en equilibrio basando la curva de concentración de crioprotector y temperatura en la de G. M. Fahy, director del equipo que consiguió vitrificar y trasplantar exitosamente riñones de conejo. Para ello se han escogido dos órganos de ratón, corazón y encéfalo, y se han sometido a una serie de procedimientos con el objetivo de diseñar y afinar la técnica de enfriamiento y encontrar puntos críticos y relaciones entre variables. Los métodos ejecutados fueron cirugía, canulación de corazón y extracción de encéfalo, el soporte vital del corazón ex vivo mediante perfusión retrógrada de corazón y, finalmente, la vitrificación de cada órgano. Las muestras fueron almacenadas en crioviales contenidos en cámaras frías a -22 ⁰C y a -196 ⁰C para su posterior evaluación sobre la cristalización y el estudio de la absorción de crioprotector en los tejidos mediante análisis de Tomografía Axial Computerizada (TAC). Los resultados fueron favorables en 6 de los 15 órganos vitrificados y analizados, con concentraciones del 36% en encéfalo y 81% en corazón. Mediante el análisis estadístico de resultados se observó una relación inesperada entre la capacidad de absorción de crioprotector del tejido y su viabilidad en el momento en el que entró a vitrificación. Se aplicaron una serie de tests estadísticos para la confirmación de significación de linealidad y, finalmente, una regresión lineal que proporcionó una ecuación para predecir el valor de concentración de crioprotector absorbido en función del tiempo de canulación del corazón durante la cirugía. El proyecto concluyó con la hipótesis de que esta relación solo puede ser posible si se considera una absorción de crioprotector por transporte activo dependiente de ATP, en contraposición a las fuentes consultadas. En cuanto a la vitrificación de encéfalo se han encontrado dificultades tanto para perfundirlo como para vitrificarlo debido a su aislamiento en el cráneo y la baja permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Se proponen una serie de mejoras del método para el análisis de viabilidad pre y post vitrificación. Como proyecto futuro se considera perfeccionar las técnicas de la fase de enfriamiento y estudiar la fase de recalentamiento mediante ultrasonidos, ya que estos permiten una transmisión de energía homogénea en todo el órgano.