Generación de líneas celulares estables que expresen diferentes formas de IκBα

Abstract

La proteína IκBα forma parte de la vía de señalización de NF-κB siendo su principal función retener el factor de transcripción secuestrado en el citoplasma hasta la aparición de un estímulo. IκBα, para la que existen varias modificaciones posttraduccionales con impacto funcional, tiene otras funciones no relacionadas con NF-κB en el núcleo celular y existen evidencias de una implicación de IκBα en algunos tipos de cáncer. Nos hemos propuesto generar líneas celulares estables que expresen distintas formas de la proteína IκBα que mimetizan modificaciones post-traduccionales naturales de la proteína para contribuir a entender su papel en el cáncer. Utilizando la transfección de fibroblastos embrionarios murinos procedentes de ratones knock out para IκBα con plásmidos recombinantes que codifican para las variantes de la proteína de interés y la selección en cultivo hemos generado una colección de clones que han resultado expresar las proteínas de interés. La caracterización de dichos clones nos ha manifestado que las diferentes variantes tienen vidas medias distintas. Así, las formas sumoiladas o la no fosforilable han resultado tener una vida media mayor. La forma sumoilada y fosforilada se encuentra, a diferencia de las demás formas, en el núcleo celular según estudios de fraccionamiento sub-celular y de immunocitoquímica. Estos últimos estudios también han revelado la heterogeneidad de los clones obtenidos en lo que hace referencia a los niveles de expresión de la proteína recombinante y nos ha hecho plantear la subclonación de cada variante para facilitar futuros experimentos. Hemos generado una herramienta que demostrará ser muy útil en el avance del conocimiento sobre IκBα.

IκB-α protein participates in NF-κB signaling pathway. Its main function is to retain the transcription factor sequestered in the cytoplasm until the appearance of a stimulus. There are different post-transcriptional modifications for IκB-α that result in a functional impact. Moreover, it has other functions that are not related to NF-κB in the cellular nucleus, and there are evidences about the IκB-α implication in some types of cancer. Our main goal is to generate stable cell lines that express different IκB-α protein variants, simulating natural post-transcriptional modifications of the protein. These will help us to better understand the role that IκB-α plays in cancer process. Using murine embryonic fibroblast transfectants from IκB-α knockout mice, with recombinant plasmids that encode for IκB-α protein variants and the selection in culture, we have generated several clone’ collections that express target proteins. Clones characterization let us see that each protein variant has different mean lifetime. Sumoylated variants and the non-phosphorylated ones, present a higher mean lifetime. These two variants, in contrast to others and according to subcellular fractionation studies and immunocytochemical analysis, are located within the nucleus. Furthermore, these analyses have allowed us to see that, related to the recombinant protein expression level, heterogeneity between the clones obtained is also observed. We have generated a powerful tool that may be useful to increase the knowledge about IκB-α. Taking into account all the results obtained, we propose for future experiments, subcloning each one of the variants, which without any doubt will make the IκB-α study easier, allowing us to move further.