Monitorització dels paràmetres respiratoris de cultius en bioreactors del llevat Pichia pastoris

Abstract

La producció de proteïnes recombinants ha esdevingut una de les aplicacions de la biotecnologia més importants. Un dels majors reptes per la indústria biotecnologia és garantir l'estabilitat i reproductibilitat dels processos per aconseguir la producció de forma continuada i segura. En les últimes dècades s'han desenvolupat i millorat sistemes de control per als bioprocessos i automatitzacions que permeten monitoritzar els paràmetres dels cultius. El desenvolupament i implementació de sistemes de control més precisos suposa un pas clau en la millora de l’eficiència dels bioprocessos. Paràmetres essencials com la temperatura, el pH o l'oxigen dissolt disposen de sensors i sistemes de control molt estandarditzats. No obstant encara es necessiten desenvolupar tècniques més precises per analitzar paràmetres més complexos sent l'estat metabòlic un exemple clar. Tradicionalment l'estat del creixement del cultiu s'analitza prenent mostres manuals i realitzant diferents tipus d’anàlisis com podria ser: determinació de biomassa, de substrats o productes, etc. Aquesta metodologia requereix la constant supervisió per part dels operaris i augmenta els riscos de contaminació. Altrament, només s'obté informació puntual a temps determinats però no monitoratge constant a temps real, també dit on-line. Recentment s'han desenvolupat alternatives automatitzades i menys invasives per controlar l'estat metabòlic del cultiu i tenir informació sobre el seu creixement. L’analitzador de gasos és una de les millors opcions per al seguiment de l'estat metabòlic dels cultius de forma no invasiva i automàtica. Addicionalment, també és una metodologia fàcilment escalable. Els cultius en continu afegeixen complexitat a les eines de monitoratge dels cultius, ja que se suma el control precís dels cabals d'entrada de medi i sortida del brou a tots els altres paràmetres esmentats anteriorment. La naturalesa de les bombes peristàltiques i dels tubs utilitzats en aquestes fa que les calibracions típiques de les bombes siguin altament imprecises i causin desviacions significatives en els perfils d'alimentació del cultiu. Per aquest motiu cal desenvolupar estratègies com l'ús de balances de precisió per assegurar que els cabals són constants i precisos al llarg de tots els experiments. En aquest projecte de final de grau s'ha treballat conjuntament amb l'empresa Bionet (Múrcia, Espanya) per realitzar les proves dels seus equips d'anàlisis de gasos i control de cabal. Tanmateix, s'han realitzat proves prèvies de calibració de la balança utilitzada per controlar el cabal d'alimentació amb un llaç de control tancat. Posteriorment s'han realitzat cultius en continu de tipus chemostat (limitats per font de carboni) per comprovar la seva fiabilitat, precisió i adaptabilitat en condicions estacionàries. En propers passos del projecte es preveu avaluar l’ús d’aquest sistema de control de l’addició de substrat amb un cultiu dinàmic de tipus fed-batch.

The production of recombinant proteins has become one of the most important applications of biotechnology. One of the greatest challenges for the biotechnology industry is to ensure the stability and reproductivity of the processes for continued and safe production. Over the past decades, control systems for bioprocesses and automation have been developed and improved, allowing the monitorization of the most relevant culture parameters. The development and implementation of more precise control systems is currently considered a key step to improve the bioprocesses efficiency. Essential parameters such as temperature, pH, or dissolved oxygen have highly standardized sensors and control systems. However, more precise techniques are still needed to analyze more complex parameters being the metabolic state being a clear example. Traditionally, the growth and state of the culture are characterized by taking manual samples and performing different types of analysis as it might be: Determination of biomass, substrates or products, etc. This methodology requires constant supervision by operators and increases the risks of contamination. Furthermore, only point information is obtained and not constant real-time monitoring. Automated and less invasive alternatives have recently been developed to control the metabolic state of the culture and to have information about its growth. Gas analyzers are one of the best options for monitoring the metabolic state of cultures non-invasively and automatically. Additionally, it is also an easily scalable methodology. Continuous cultures add further complexity to the bioprocess, as they add precise control of the media input and output flow rates to the parameters mentioned above. The nature of the peristaltic pumps and the silicon tubes used in them makes the typical calibrations of the pumps not accurated enough and causes significant deviations in the feeding profiles of the cultures. For this reason, strategies such as the use of precision scales to ensure that feeding is constant and accurate throughout the experiment are being developed. In this final degree project, we have worked together with the company Bionet (Murcia, Spain) to perform the tests of their gas analyzer and flow control equipment. Various culture strategies have been tested to check the time response and accuracy. Continuous cultures of chemostat (carbon-limited) types have subsequently been performed to check the reliability, accuracy, and adaptability in stationary conditions of the gas analyzer and feeding system. In the next steps of the project, it is planned to evaluate the use of this substrate addition control system with a dynamic culture of fed-batch type.