Transformació i producció d'una proteïna recombinant d'interès comercial en Picchia pastoris

Abstract

En aquest projecte es desenvolupa una estratègia per produir amb més quantitat i més econòmicament la proteïna DFV-D1, una proteïna d’interès comercial i facilitar-ne l’ús en productes veterinaris: la producció de la proteïna amb Pichia pastoris. S’ha aconseguit clonar el gen d’interès dins del vector pPICZα i s’ha transformat la soca X-33 de Pichia pastoris amb èxit. Un cop incorporat el gen dins el genoma de Pichia s’han escollit aquells clons que tenien el fenotip Mut+ i s’ha mirat si algun dels clons feia la proteïna d’interès. Per mirar si es produïa la proteïna s’ha posat a punt nou sistema de visualització de proteïnes recombinants, en concret un sistema de visualització ràpid basat en la immunodetecció per tal de poder visualitzar la presència d’una determinada proteïna a una concentració superior a 1 μg / ml. Mitjançant aquest sistema i amb un western-blot s’ha vist que alguns dels clons obtinguts de Pichia resistents a Zeocina produïen la proteïna d’interès. Un cop obtingut clons que produïen la proteïna s’ha fet un cultiu per mirar si es produeix la proteïna d’interès a escala d’erlenmeyer i per mirar si es produeix la mateixa quantitat de proteïna que s’ha aconseguit en la documentació. Malauradament no s’ha pogut produir la proteïna. També s’ha mirat si la proteïna obtinguda en Pichia té la mateixa activitat que la que es produeix actualment, però ha resultat no tenir activitat.

In this project, a new strategy to produce more quantity and more economically DFV-D1 protein is developed: production of DFV-D1, a protein of commercial interest with Pichia pastoris. The gene of interest has been cloned into the vector pPICZα and Pichia pastoris X-33 strain has been transformed with this vector successfully. Once the gene was integrated into Pichia genome, the clones with the Mut+ phenotype were selected to see if any of those clones were capable to produce the protein of interest. To see if the clone were capable to make the protein, a new system of recombinant protein visualization was developed, a system based on quickly immunodetection in order to detect a determinant protein with a minimum concentration of 1 μg/ml. With this system and with a western-blot, clones capable to produce the protein of interest have been obtained. Once obtained these clones, an Erlenmeyer culture has been developed to produce the protein of interest and see if we were capable to produce the same amount of protein that has been achieved in the bibliography. Unfortunately we were not able to produce the protein of interest. Moreover, the activity of the protein produced with Pichia has been evaluated to see if it had the same activity as compared with the protein produced with another microorganism, but activity was observed.