Desenvolupament d’un bioprocés robust en fed-batch per la producció de nanobodies (VHH i IgG) amb l’organisme d’expressió Pichia pastoris sota el control de PGAP.

Abstract

Dins la biotecnologia industrial, els anticossos han captat un gran interès per la seva especificitat i l’ampli rang de potencials aplicacions. El cost acostuma a ser molt elevat a causa de la complexitat en l’expressió i plegament, que fa necessari l’ús de bioprocessos molt cars. L'enginyeria de proteïnes ha estat fonamental per a reduir la complexitat i mida dels anticossos. Un avenç va estar el descobriment d'anticossos d'una sola cadena en un camell dromedari, nanobodies (VHH i IgG), que tenen propietats similars a les dels convencionals i s'expressen fàcilment en hostes microbians com Pichia pastoris. En general, l’eficiència dels processos de fermentació estan influenciats per diferents paràmetres operacionals incloent la temperatura, el pH, oxigen dissolt, el medi... A més a més, la selecció del promotor, o el sistema d’expressió, té un paper essencial en el desenvolupament del bioprocés, ja que acostumen a determinar l’estratègia de fermentació. En aquest projecte, s’ha treballat en col·laboració amb l’empresa Bionet (Múrcia, Espanya) i l’institut de Biotecnologia de Flandes VIB-Ghent (Gant, Bèlgica) per desenvolupar un bioprocés robust per la producció de dos tipus de nanobodies (VHH i IgG) amb l’organisme d’expressió Pichia pastoris sota el control de PGAP. Aquests nanobodies tenen afinitat per la proteïna GFP i s’espera que puguin ser d’interès per aplicacions dins del grup de recerca QuBI-Lab (Vic, Espanya). Durant aquest projecte s’han realitzat 5 cultius en el mètode operacional fed-batch per determinar les condicions de producció més favorables. Aquests s’han monitoritzat per mètodes off-line (densitat òptica i mètodes de quantificació de proteïna), les variables de la fermentació (pH, oxigen dissolt, temperatura i agitació) i els gasos de sortida del fermentador (CO2 i O2, així com RQ). Addicionalment, s’han avaluat les primeres etapes de downstream obtenint resultats molt prometedors. A més, s’ha avaluat la implementació d’un nou sistema d’addició de substrat en llaç de control tancat, per així millorar la seva precisió. Com a resultats més rellevants, cal destacar que s’ha aconseguit avaluar de forma satisfactòria l’ús de l’anàlisi de gasos i del control d’addició de substrat en llaç tancat, el que és de gran interès per l’empresa Bionet. Addicionalment, també s’ha dissenyat i implementat un bioprocés que permet assolir quantitats significatives tant de VHH com d’IGG, de gran interès per VIB-Ghent i QuBi Lab. Finalment, s’ha identificat com es podria millorar els rendiments de producte obtinguts.

Within industrial biotechnology, antibodies have attracted a great deal of interest due to their specificity and the wide range of potential applications. The cost is usually very high due to the complexity of the expression and folding, which makes it necessary to use very expensive bioprocesses. Protein engineering has been instrumental in reducing the complexity and size of antibodies. One breakthrough was the discovery of single-chain antibodies in a camel dromedary, nanobodies (VHH and IgG), which have properties similar to those of conventional ones and are easily expressed in microbial hosts such as Pichia pastoris. In general, the efficiency of fermentation processes are influenced by different operational parameters including temperature, pH, dissolved oxygen, the environment etc. In addition, the selection of the promoter, or expression system, has an essential role in the development of the bioprocess, as they usually determine the fermentation strategy. In this project, we have worked in collaboration with the company Bionet (Murcia, Spain) and the Institute of Biotechnology of Flanders VIB-Ghent (Ghent, Belgium) to develop a robust bioprocess for the production of two types of nanobodies (VHH and IgG) with the expression organism Pichia pastoris under the control of PGAP. These nanobodies have an affinity for the GFP protein and are expected to be of interest for applications within the QuBI-Lab research group (Vic, Spain). During this project, 5 cultures were carried out in the fed-batch operating method to determine the most favorable production conditions. These have been monitored by offline methods (optical density and protein quantification methods), fermentation variables (pH, dissolved oxygen, temperature and agitation) and fermenter outlet gases (CO2 and O2, as well as RQ). In addition, the early stages of downstream steps have been evaluated with very promising results. In addition, the implementation of a new closed loop control substrate addition system has been evaluated to improve its accuracy. More relevant results include the successful evaluation of the use of gas analysis and closed loop substrate addition control, which is of great interest to the Bionet company. In addition, a bioprocess has been designed and implemented to obtain significant amounts of both VHH and IGG, of great interest to VIB-Ghent and QuBi Lab. Finally, it has been identified how the product yields could be improved.