Caracterització funcional i computacional de mutacions dels gens grins

Abstract

Keywords: Glutamatergic synapse, NMDA receptor, GRIN, disease-associated mutations.

Glutamatergic synapse is crucial for synaptic plasticity, neuronal development, learning, and memory. Glutamate binds to ionotropic N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, producing excitatory postsynaptic potential. Autosomal dominant or de novo GRIN gene variants are associated with GRIN related disorders (GRDs), rare pediatric encephalopathies caused by NMDA receptor malfunction; clinically manifested as intellectual disability, hypotonia, and epilepsy. In order to select the best strategic therapy, the variants need to be classified as loss-of-function (LoF) or gain-of-function (GoF). This experimental variant stratification is time consuming and thus computational approaches to predict variant pathigenesis and functionallity are being used. 10 GRIN de novo missense variants from patients without functional classification have been functionally characterized. Methods used for the functional characterization include primer design, site-directed PCR Mutagenesis, DNA precipitation, bacterial transformation, DNA extraction and quantification, Sanger sequence analysis, CalPhos and Lipofectamine transfection, western blot, and immunofluorescence. From these, 3 variants had correct composition and expression of NMDA receptor. In addition, these 10 variants have been introduced in the NMDA molecular model to see the molecular changes caused by the mutation. Besides, in order to understand the most vulnerable regions of the NMDA receptor, and the regions related to LoF or GoF, functional and pathogenic information of all previously reported GRIN missense variants from the GRIN data base (GRINdb) and GenomAD were mapped and integrated in the already determinate triheteromeric molecular model of the NMDA receptor in PyMOL, via a computational assay based on Python scripts. The model Results indicates that pathogenic variants mainly affect the the ligand-binding domain (LBD) and transmembrane domain (TMD), while the LBD is mostly affected by LoF variants. Overall, these results contribute to a better understanding of how missense variants affect the structure and the function of the receptor.

Paraules clau: sinapsi glutamatèrgica, receptor NMDA, GRIN, mutacions associades a patologia. La sinapsi glutamatèrgica és crucial per a la plasticitat sinàptica, el desenvolupament neuronal, l’aprenentatge i la memòria. El glutamat s'uneix als receptors ionotròpics de N-metil-D-aspartat (NMDA), produint potencial postsinàptic excitador. Les variants dels gens GRIN autosòmiques dominants o de novo s'associen amb trastorns relacionats amb gens GRIN (GRD), un grup d’encefalopaties pediàtriques rares causades per un mal funcionament del receptor NMDA; clínicament es manifesta com a discapacitat intel·lectual, hipotonia i epilèpsia. Per seleccionar la millor teràpia, les variants s'han de classificar com a pèrdua de funció (LoF) o guany de funció (GoF). Aquesta estratificació de variants experimentals requereix temps i, per tant, s'utilitzen enfocaments computacionals per predir la patogènesi i la funcionalitat de les variants. S'han caracterizat funcionalment 10 variants GRIN de novo sense sentit de pacients sense classificació funcional. Els mètodes utilitzats per a la caracterització funcional inclouen disseny de primers, PCR mutagènesi dirigida, precipitació d'ADN, transformació bacteriana, extracció i quantificació d'ADN, anàlisi de seqüències amb Sanger, transfecció amb CalPhos i Lipofectamina, western blot i immunofluorescència. D'aquestes, 3 variants tenen la composició i l'expressió correctes del receptor NMDA. A més, aquestes 10 variants s'han introduït al model molecular NMDA per veure els canvis moleculars causats per la mutació. D’altra banda, per tal d'entendre les regions més vulnerables del receptor NMDA i les regions relacionades amb LoF o GoF, la informació funcional i patogènica de totes les variants “missense” de GRIN previament caracteritzades a la base de dades GRIN (GRINdb) i GenomAD han estat mapejades i integrades al prèviament determinat model molecular triheteromèric del receptor NMDA a PyMOL, mitjançant un assaig computacional basat en scripts Python. Els resultats del model indiquen que les variants patogèniques afecten principalment el domini d'unió al lligand (LBD) i el domini transmembrana (TMD), mentre que el LBD es veu afectat principalment per variants LoF. En general, aquests resultats contribueixen a una millor comprensió de com les variants de missense afecten l'estructura i la funció del receptor.