Estudi de l'eficàcia d'un vector episomal amb seqüència PARS i marcador de selecció basat en la font de carboni en Pichia pastoris

Abstract

Títol: Estudi de l’eficàcia d’un vector episomal amb seqüència PARS i marcador de selecció basat en la font de carboni en Pichia pastoris Autora: Maria Sánchez Co-Tutores: Dr. Xavi Garcia Ortega (DEQBA – UAB) i Dra. Montserrat Capellas Herms (UVic-UCC) Data: Juny de 2023 Paraules clau: Pichia pastoris, bioprocés, vectors d’expressió, vector episomal, marcadors de selecció Els cassets d’expressió per la producció de proteïnes recombinants, generalment, s’integren en llocs concrets del genoma, obtenint soques d’expressió estables. No obstant, el llevat Pichia pastoris presenta variabilitat clonal, fent que el lloc d’integració del vector en el genoma sigui, sovint, diferent en totes les cèl·lules transformades. Aquesta diferència provoca usualment discordances en els rendiments de producció entre els diferents clons, fent necessàries tècniques de high-thoughput screening per la selecció dels millors clons. En aquest treball, s’avalua l’eficàcia d’un vector episomal creat dins del projecte CD-Lab (TU Graz, Àustria) capaç de replicar-se ell sol sense la necessitat d’integrar-se en el genoma. Aquesta opció evita la variabilitat clonal i permet la preparació ràpida de soques amb elevada productivitat i rendiments, reduint costos i temps. No obstant això, requereixen un marcador de selecció constant per mantenir-se dins de l’organisme. En aquest cas, s’utilitza el gen GUT1, imprescindible per la metabolització del glicerol. Es realitzen cultius en fed-batch amb les mateixes condicions per comparar els resultats entre soques amb el plasmidi episomal i soques amb el mateix plasmidi integrat en el genoma. També, s’analitza el funcionament del promotor PCAT1. Així doncs, es mesuren diferents paràmetres com biomassa, paràmetres respiratoris, anàlisis d’HPLC i d’activitat enzimàtica, així com altres valors on-line del fermentador. Els resultats obtinguts dels cultius amb el vector episomal presenten productivitats de proteïna model, la lipasa de Candida antartica B (CalB), més elevades que els cultius de referència, fent que aquest sigui un possible nou vector per la producció de proteïnes recombinants.

Title: Study of the efficacy of an episomal vector with a PARS sequence and a selection marker based on the carbon source in Pichia pastoris Author: Maria Sánchez Lorite Supervisor: Dr. Xavi Garcia Ortega (DEQBA – UAB) and Dra. Montserrat Capellas Herms (UVic-UCC) Date: June 2023 Keywords: Pichia pastoris, bioprocess, expression vectors, episomal vector, selection markers Expression cassettes for the production of recombinant proteins are generally integrated into specific sites of the genome, obtaining stable expression strains. However, the yeast Pichia pastoris exhibits clonal variability, making the site of vector integration into the genome to be often different in all transformed cells. This difference frequently leads to discrepancies in production yields between different clones, making high-throughput screening techniques necessary for the selection of the best clones. This work evaluates the effectiveness of an episomal vector created within the CD-Lab project (TU Graz, Austria) capable of self-replication without the need to integrate into the genome. This option avoids clonal variability and allows the rapid preparation of strains with high productivity and yields, reducing costs and time. However, they require a constant selection marker to remain within the organism. In this case, the GUT1 gene is used, which is essential for glycerol metabolism. Fed-batch cultures are performed under the same conditions to compare results between strains with the episomal plasmid and strains with the same plasmid integrated into the genome. Likewise, the functioning of the PCAT1 promoter is analysed. Therefore, different parameters such as biomass, respiratory parameters, HPLC and enzyme activity analyzes are measured, as well as other online values of the fermenter. The results obtained with cultures with the episomal vector present productivities of the model protein, Candida antartica lipase B (CalB), superior to the reference cultures, making this a possible new vector for the production of recombinant proteins.